Determination of SNP 5mC/T in AluSx repeat (Chr16: 75033884) in DNA samples from the human blood by GlaI- and FatI-PCR assay

A.G. Akishev; N.A.Netesova; M.A. Abdurashitov; S.Kh. Degtyarev

DiagnosticsResearch articleNew methods

Determination of SNP 5mC/T in AluSx repeat (Chr16: 75033884) in DNA samples from the human blood by GlaI- and FatI-PCR assay

Akishev A.G., Netesova N.A., Abdurashitov M.A., Degtyarev S.Kh.

On Apr 13, 2021 0

A.G. Akishev¹, N.A.Netesova², M.A. Abdurashitov¹, S.Kh. Degtyarev¹

¹ SibEnzyme, Novosibirsk
² Epigenlab, Novosibirsk

* corresponding author: Alexander Akishev, SibEnzyme, 2/12 Ak.Timakov Str., Novosibirsk 630117, Russia; Tel: +7 383 3334991; Fax: +7 383 3336853; E-mail: aki@sibenzyme.ru

SNP 5mC/T in AluSx repeat (Chr16: 75033884) in DNA samples from the human blood of 92donors was studied by GlaI and FatI-PCR assay. The work includes a) isolation of DNA from the blood cells, b) GlaI and FatI-PCR assay of DNA fragment Chr16: 75033860 – 75033957, c) determination of 5mC (Chr16: 75033884) and thymine (Chr16: 75033884) в in DNA preparations and d) comparative analysis of the obtained results.

It was shown that in position (Chr16: 75033884) 53 donors (57,61%) have a heterozygote (5mC-T), 19 donors (20,65%) have homozygote (T-T) and 20 donors (21,74%) have homozygote (5mC-5mC). Thus, taking into account a diploid set of chromosomes in the blood cells, SNP 5mC/T is observed in 70 positions from 156 (49,46%).

The results obtained have shown that cytosine in position Chr16: 75033884 in the most of the blood DNA is methylated in accordance with a literature data about a significant methylation of CG-dinucleotides in Alu-repeats.

Keywords: SNP 5mC/T analysis, DNA from human blood, GlaI-PCR assay, FatI-PCR assay

DOI: 10.26213/SE.2021.11.76.001

Citation::

A.G. Akishev, N.A.Netesova, M.A. Abdurashitov, S.Kh. Degtyarev Determination of SNP 5mC/T in AluSx repeat (Chr16: 75033884) in DNA samples from the human blood by GlaI- and FatI-PCR assay. Epigenet DNA diagnx, vol.1, 2021, DOI: 10.26213/SE.2021.11.76.001

This work is available at Creative Commons licence «Attribution-NonCommercial» 4.0 International.

Full-text-pdf

Sorry. Full text is available only on Russian

Рисунок 1.

Нуклеотидная последовательность анализируемого участка геномной ДНК

Таблица 1.

Пол и возраст доноров крови, концентрация и фотометрическая чистота полученной лейкоцитарной ДНК

N донора	Пол	Возраст, лет	Концентрация ДНК, нг/мкл	А260/А280	N донора	Пол	Возраст, лет	Концентрация ДНК, нг/мкл	А260/А280
1172	жен	14	376	1.60	1111	жен	50	141	1.70
1164	жен	17	252	1.70	1151	жен	50	225	1.70
1147	муж	18	180	2.00	1087	жен	51	95	1.70
1133	муж	18	55	1.70	1093	муж	51	201	1.70
1187	муж	20	304	1.80	1129	жен	51	72	1.70
1502	жен	20	461	1.70	1165	муж	51	356	1.60
1487	жен	22	406	1.70	584	муж	53	72	1.90
1304	жен	23	129	1.70	1159	муж	53	358	1.70
1218	муж	24	317	1.70	1358	муж	53	784	1.80
1379	жен	24	241	1.80	587	жен	54	41	1.90
1243	муж	24	280	1.70	561	муж	56	50	1.80
1332	муж	25	507	1.90	1280	муж	56	436	1.80
1173	жен	27	232	1.70	1127	жен	57	123	1.70
1200	муж	27	271	1.60	1135	жен	57	127	1.60
1203	муж	27	309	1.60	1163	жен	57	157	1.70
1209	муж	27	204	1.70	1130	жен	58	59	1.70
1214	жен	27	265	1.60	1137	жен	59	299	1.60
1329	муж	27	488	1.80	1348	муж	60	761	1.70
1225	муж	28	114	1.90	1349	муж	62	355	1.80
1226	жен	30	297	1.90	1294	муж	63	173	1.60
1221	жен	31	263	1.70	1369	жен	63	301	1.90
1134	муж	32	53	1.70	1277	жен	64	330	1.70
571	муж	33	30	1.80	1152	жен	65	112	1.70
1161	муж	33	197	1.70	1205	муж	65	420	1.70
1192	жен	33	110	1.70	237	муж	66	31	1.80
1184	жен	34	305	1.70	d559	жен	66	37	1.70
1208	муж	35	207	1.60	1143	жен	67	84	1.60
604	жен	36	52	1.90	1428	муж	67	433	1.80
1086	муж	36	193	1.70	1365	жен	68	204	1.80
1217	муж	36	407	1.60	173	муж	68	352	1.70
1247	жен	36	286	1.70	1437	муж	68	213	1.80
1235	жен	37	168	1.70	240	муж	69	18	1.90
1345	муж	37	420	1.80	1146	жен	70	149	1.80
1094	жен	38	172	1.70	1413	муж	70	522	1.90
1219	жен	41	315	1.80	40	жен	72	179	1.80
1381	жен	41	500	1.70	205	жен	72	461	1.80
1207	муж	42	220	1.60	1115	муж	72	78	1.70
1323	муж	42	300	1.80	1576	муж	72	307	1.80
1411	муж	42	569	1.80	178	муж	73	182	1.70
1145	жен	45	323	1.60	1669	муж	74	351	1.70
1171	жен	45	67	1.60	121	жен	75	163	1.70
1491	жен	46	498	1.70	1168	жен	79	239	1.70
603	жен	47	108	1.90	1174	жен	79	271	1.60
1155	муж	48	110	1.60	1160	жен	80	195	1.70
1338	муж	49	696	1.80	55	жен	81	221	1.70
1099	муж	50	144	1.70	56	муж	81	414	1.70

Рисунок 2.

Кривые флюоресценции для ПЦР с использованием убывающих количеств HinfI-фрагментов геномной ДНК образца 1087 (верхний ряд) и геномной ДНК клеточной линии Raji (нижний ряд) и стандартные кривые для проведенных реакций.

Таблица 2.

Значения Cq в случае гидролиза ДНК по сайтам GANTC (HinfI), CATG (Fat-ПЦР анализ) и A(5mC)GC (GlaI-ПЦР анализ) и значения разницы величины Cq для двух последних реакций относительно первой (ΔCq_T и ΔCq_5mC), соответственно.

Рисунок 3

Сверху – Значения ΔCq_5mC и ΔCq_T Cq для 92-х образцов донорской ДНК лейкоцитов (красным и синим цветом, соответственно). Снизу – процент молекул ДНК, нерасщепленных в ходе GlaI- и FatI-ПЦР анализа, относительно общего количество молекул ДНК, определенных ПЦР анализом HinfI-гидролизатов (красным и синим цветом, соответственно).