GlaI

Методом GLAD-ПЦР анализа определяли метилирования сайтов RCGY в регуляторной области гена FAM19A4 (Хр3: 68932451 - 68932800) в препаратах ДНК малигнантных клеточных линий человека Raji, Jurkat, HeLa, U-937 и контрольной ДНК клеточной линии фибробластов легких L68. Показано, что октануклеотид GCGCGCGC (Хр3: 68932500), находящийся в первом экзоне гена FAM19A4, расщепляется приблизительно в равной степени в ДНК всех 4-х малигнантных клеточных линий человека, тогда как в ДНК L68 этом сайт гидролизуется в 10-15 раз слабее. Эти результаты соответствуют полученным ранее данным эпигеномного секвенирования ДНК L68, Raji и U-937. Метилирование CG-динуклеотидов в позициях 68932727 и/или 68932740 в районе промотора гена FAM19A4 происходит только в опухолевых ДНК и не наблюдается в ДНК L68, а метилирование CG-динуклеотида в позиции 68932704 наблюдается только в ДНК HeLa.

Методами GlaI- и FatI-ПЦР анализа определяли частоты вариантов полиморфизма 5mC/T в положении хр1: 245618129 (по геномной сборке GRCh38.p13) в препаратах ДНК, выделенной из клеток крови 92 человек. Исследование включало (1) выделение лейкоцитарной ДНК из клеток крови, (2) проведение GlaI- и FatI-ПЦР анализа фрагмента ДНК хр1: 245617889 - 245618464, (3) определение 5-метилцитозина и тимина в позиции хр1: 245618129 в анализируемых препаратах ДНК и (4) сравнительный анализ полученных результатов. Показано, что 43 донора (46,74%) имеют гетерозиготный набор C/T в положении хр1: 245618129, 28 доноров (30,43%) гомозиготны по T, а 21 донор (22,83%) – по C. Таким образом, принимая во внимание, что клетки крови имеют диплоидный набор хромосом, замена C на T встречается в 99 из 184 проанализированных вариантов (53,8%). При этом из полученных результатов следует, что цитозин в положении хр1: 245618129 в бОльшей части молекул ДНК находится в метилированной форме (5-метилцитозин).

Методами GlaI- и FatI-ПЦР анализа определяли частоты вариантов полиморфизма 5mC/T в повторе AluSx в положении хр16: 75033884 (по геномной сборке GRCh38.p13) в препаратах ДНК, выделенной из клеток крови 92 человек. Исследование включало (1) выделение лейкоцитарной ДНК из клеток крови, (2) проведение GlaI- и FatI-ПЦР анализа фрагмента ДНК хр16: 75033860 - 75033957, (3) определение 5-метилцитозина и тимина в позиции (хр16: 75033884) в анализируемых препаратах ДНК и (4) сравнительный анализ полученных результатов. Показано, что 53 донора (57,61%) имеют гетерозиготный набор C/T в положении хр16: 75033884, 19 доноров (20,65%) гомозиготны по T, а 20 доноров (21,74%) – по C. Таким образом, принимая во внимание, что клетки крови имеют диплоидный набор хромосом, замена C на T встречается в 91 из 184 проанализированных вариантов (49,46%). При этом из полученных результатов следует, что цитозин в положении хр16: 75033884 в бОльшей части молекул ДНК находится в метилированной форме (5-метилцитозин), что согласуется с положением о преимущественном метилировании CG-динуклеотидов в Alu-повторах.

Методом GlaI-ПЦР анализа изучали метилирование сайта ACGC в гене SIPA1 в положении хр11: 65647266 (согласно базе данных GRCh38 PrimaryAssembly) в препаратах ДНК, полученных из легкой фракции клеток крови доноров и больных раком молочной железы на ранних стадиях заболевания. Исследование включало а) получение легкой фракции клеток крови, б) выделение геномной ДНК, в) установление методом ПЦР в реальном времени концентрации геномной ДНК, г) определение методом GlaI-ПЦР-анализа концентрации неметилировнного сайта ACGC в положении хр11: 65647266 в препаратах ДНК из легкой фракции клеток крови и д) определение доли молекул ДНК, содержащих неметилированный сайт ACGC, выраженной в процентах от общего количества молекул ДНК. GlaI-ПЦР анализ показал, что у более чем 82% доноров доля неметилированного сайта ACGC в положении хр11: 65647266 в ДНК из легкой фракции клеток крови составляет 3% и менее, тогда как у приблизительно 70% больных РМЖ процент неметилированного сайта ACGC выше и находится в диапазоне от 3,2 до 6,4%. Эти данные позволяют предположить, что при РМЖ на ранних стадиях у 2/3 больных в ДНК небольшой части лейкоцитов (до 3,5%) происходит деметилирование сайта A(5mC)GC в гене SIPA1 в положении 65647266. Данные, представленные в данной работе, могут быть использованы для разработки ПЦР тест-системы, позволяющей исключить РМЖ на ранних стадиях. Метод GlaI-ПЦР анализа не требует сложного и дорогостоящего оборудования и реактивов, а само исследование может проводиться в стандартной ПЦР-лаборатории в ходе ежегодных профилактических обследований и анализа крови.

В настоящей работе представлены результаты картирования  метилированных сайтов RCGY в геномах двух  малигнантных клеточных линий и контрольной клеточной линии фибробластов легких. Проведенный анализ выявил существенные отличия по метилированию генов, повторов, CpG-островков между тремя геномами. Обнаружены различия по степени метилирования  различных групп повторов, которые, возможно, могут быть использованы в диагностических целях при условии разработки достаточно чувствительных методов анализа. Создана база данных, содержащая результаты картирования метилированных сайтов в геномах. Полученные данные по метилированию регуляторных участков различных генов, сопоставленные с ранее опубликованными данными, могут быть использованы для поиска маркеров метилирования для диагностики онкологических и некоторых других заболеваний. Таким образом, разработанный простой и нетрудоемкий метод картирования метилированных сайтов R(5mC)GY в геномах может быть использован на практике.